原花青素的結(jié)構(gòu)及其組成單元

1．2 原花青素的主要性質(zhì)

原花青素在熱酸條件下能夠生成紅色的花青素，此性質(zhì)可用于原花青素的定性和定量分析。結(jié)構(gòu)中具 有較多的羥基，具有較大的極性，使其能夠很好的溶解 于水、甲醇、丙酮、乙醇等極性溶劑而不溶解于苯、氯 仿、石油醚等非極性物質(zhì)。較多羥基結(jié)構(gòu)也使其成為良 好的氫原子給予體，具有較強的抗氧化性質(zhì)。研究表 明，在0 一、·OH、·CH，中，原花青素對0：一·清除能力最 好，而且在聚合度2～5之間范圍內(nèi)，隨聚合度增加而增 加柳。對其構(gòu)效關(guān)系分析表明，帶有沒食子酰基的原花青 素具有更強的抗氧化活性，二聚體的抗氧化活性均比單 體兒茶素的活性強。c 一c 連接的二聚體比c 一c 連 接的二聚體具有更強的抗氧化活性 。原花青素的最大 吸收波長在280 nm附近，使其具有較強的紫外吸收能 力。以上的主要性質(zhì)使原花青素很好的用于保健食品 和化妝品的開發(fā)。

13 原花青素產(chǎn)品的安全性

美國Creighton大學(xué)葡萄籽原花青素研究組與美 國環(huán)境保護局根據(jù)有毒物質(zhì)控制條例健康效果測試手 冊協(xié)同進行了葡萄籽原花青素萃取物(GSPE)的一系 列毒性和生物功效研究。結(jié)果證明GSPE具有很高的 安全性和很好的清除自由基、抗氧化能力【8】。日本學(xué)者 Yamakoshi等也采用一系列毒理性試驗確證富含原花 青素的葡萄籽提取物具有很高的安全性。完全可以用 于功能性食品的開發(fā).

2 原花青素的提取方法

提取原花青素常用的方法有水提取法、有機溶劑一 水提取法和儀器輔助提取法。葡萄籽中的原花青素物 質(zhì)通常以結(jié)合態(tài)與蛋白質(zhì)、纖維素結(jié)合在一起fl01，一般 不易提出，通常選用有機溶劑或水提取，具有斷裂氫鍵 的作用。同時由于有機溶劑的滲透性較差，一般不單獨 使用，常需要水作為傳質(zhì)劑。

2．1 水提取法

Masquelier~l-嘬早從松樹皮中用沸水粗提、乙酸乙 酯純化得到原花青素。選水作為提取劑，浸提耗時長， 溫度高，容易造成原花青素的損失。同時水的極性較 大，溶出雜質(zhì)也較多。

2．2 有機溶劑一水提取法

甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青 素常用的有機溶劑，它們對原花青素有很好的溶解性， 它們的極性大II,Jt~序為甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯。 乙醇是常用的提取溶劑，價格低廉，來源豐富。乙酸乙 酯提取出的原花青素成分生物活性較好，但是由于極 性較小，對原花青素的提取并不完全。甲醇和丙酮水溶 液(50％～75％)對原花青素都有較好的提取性能，同時也多用做原花青素含量測定時的提取溶劑。熊何 -21比 較了甲醇、乙醇、丙酮水溶液對多酚的提取效果，結(jié)果 表明70％丙酮水溶液為最好溶劑。丙酮水溶液提取效 果好的原因：原花青素分子含有多個苯環(huán)和醚鍵，油溶 性較強，同時又有大量的羥基連接在分子骨架上，在水 中具有很好的溶解性，擁有油水雙溶性的丙酮與之相 互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相應(yīng)得 到提高。

2-3 儀器輔助提取法

超臨界萃取和超聲波輔助提取越來越多的用于葡 萄籽原花青素的提取。超臨界CO：萃取率高，而且使原 花青素不受到空氣和光的影響，但由于設(shè)備昂貴，推廣 使用比較困難。超聲波法應(yīng)用比較廣泛，超聲波產(chǎn)生的 強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應(yīng)、攪拌等特殊 作用，可以破壞植物的細胞壁，使溶劑滲透到細胞中， 令其中的化學(xué)成分溶于溶劑中，從而提高提取效率。 在提取原花青素之類的熱敏性物質(zhì)顯示出優(yōu)越的性 能.

3 葡萄籽原花青素的檢測

由于葡萄籽和葡萄籽提取物中大多數(shù)多酚是原花 青素(一般占70％～85％)，所以很多廠家使用原花青 素來標(biāo)定其中有效成分的含量。原花青素含量是反映 葡萄籽提取物或葡萄籽質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，主要有兩個 指標(biāo)，分別為原花青素值和原花青素含量。

3．1 原花青素值的測定

原花青素值的測定采用Bates—smith法和Poaer 法。原理：原花青素在酸性條件下加熱轉(zhuǎn)化為紅色的花 青素，而兒茶素、表兒茶素等黃烷一3一醇單體沒有此反 應(yīng)(圖2)。它們測出的結(jié)果是原花青素的相對含量，分 別用原花青素指數(shù)和PVU表示，是根據(jù)經(jīng)驗公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指數(shù)一般在80～100之 間，PVU一般在250～350之間。

原花青素值只是相對含量，并非原花青素的真實 含量。據(jù)調(diào)查，同為原花青素值95的產(chǎn)品，多酚含量相 差15％，質(zhì)量大相徑庭四。很多生產(chǎn)廠家使用原花青素 指數(shù)來表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是錯誤的。

圖2 花青素生成反應(yīng) Fig．2 Reaction ofproducing cyaniding

3．2 原花青素含量的測定

原花青素的含量測定方法很多，也比較混亂。常用 的有以下幾種方法。

3．2．1 鐵鹽催化法

此方法的反應(yīng)原理與原花青素值測定原理相 同，在計算原花青素的含量時使用了原花青素標(biāo)準(zhǔn) 品。Fe¨、鹽酸為常用的催化劑和酸解劑。由于水、乙 醇為反應(yīng)介質(zhì)時吸光值很低，一般采用正丁醇為反 應(yīng)介質(zhì)【15-161。通常的具體操作：取1．0 mL樣液(或原花 青素溶液)于10 mL刻度試管中，加入6．0 mL正丁醇一 濃鹽酸(95：5)與2％ 硫酸鐵銨溶液(溶解于2 mol／L 鹽酸)0．2mL，混勻，置于沸水浴中加熱40min后，立即 取出用冰水快速冷卻至室溫，在550 Nm處測定吸光值。

此方法較簡便，而且對原花青素的選擇性反應(yīng)較 好。鐵鹽催化法對反應(yīng)體系中的含水量和Fe 濃度要求 比較嚴格，一般要求含水量6％，F(xiàn)e 濃度4．5x10 ％， 而且過高的Fe¨濃度對反應(yīng)沒有影響【l51。傅武勝【l61 研究表明3％～4％為合適的含水量，F(xiàn)e 濃度選擇在 9．OxlO ％左右。但是也有學(xué)者總結(jié)分析2％～6％含 水量對花青素的形成有抑制作用，稍高的Fe¨濃度 (>15 g／L)也抑制花青素的生成.

在鐵鹽催化反應(yīng)的基礎(chǔ)上，楊大進【l I等人利用高 效液相色譜法檢測了原花青素含量。該方法將原花青 素在上述鐵鹽催化條件下生成的深紅色花青素離子 進行高效液相色譜分析，從而確定原花青素的含量。 此方法能夠排除部分雜質(zhì)的影響，具有定性定量準(zhǔn)確 的優(yōu)點。

3．2．2 香草醛法

測定原理：原花青素和兒茶素類單體的A環(huán)的化 學(xué)活性較高，在酸性條件下，其上的問苯二酚或間苯 三酚與香草醛發(fā)生縮和，產(chǎn)物在濃酸作用下形成紅色 的正碳離子，樣品的濃度與產(chǎn)生的顏色呈正相關(guān)，在500 llm波長下測定其吸收光值【l91(圖3)

圖3 酚醛縮合反應(yīng)

香草醛法測定時，一般以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)物，以甲醇為溶劑。鹽酸、硫酸均可作為反應(yīng)過程的催化劑，但在 使用硫酸時，濃度不易過高，過高的硫酸易使香草 醛發(fā)生自縮合反應(yīng)和氧化分解 。具體的操作方式 較多：1 mL試液+2．5 mL 1％香草醛甲醇溶液+2．5 mL 25％硫酸或8％鹽酸(均溶解于甲醇)，30?！径路磻?yīng) 15 min～20 min【2l。丑 ；1 mL試液+6 mL 4％香草醛甲醇 溶液+3 mL濃鹽酸，室溫下反應(yīng)15 minL231；有的更是在 2O℃下反應(yīng)15 h[241。操作方式差別較大，不利于使用 者的選擇，有待于統(tǒng)一。

3．2_3 紫外分光光度法

原花青素為無色物質(zhì)，在可見光區(qū)無特征吸收峰， 在紫外區(qū)有唯一特征吸收峰，最大吸收波長在280 Nm 處。盡管此方法簡單快捷，但是此方法只適用于原花青 素含量純度特別高的產(chǎn)品，不適合一般原料中原花青 素的檢測。這是因為兒茶素類在280 Nm處也有最大吸 收，V 、Vc、Ve。、Ve 、蘆丁、B一胡蘿卜素等物質(zhì)在此波長 處都有明顯的吸收.

3．2．4 Folin—Ciocaheau與HPLC結(jié)合法

此方法為美國葡萄籽方法評定委員會推薦使用的 方法。Folin—Ciocaheau法測定的是多酚含量，一般以沒 食子酸為對照物。在堿性溶液中，多酚可以將鎢鉬酸還 原，生成藍色的化合物，在760 Nm處有最大吸收。葡萄 籽提取物中的多酚含量一般在75％～95％之間。利用 HPLC測定沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒 食子酸酯四種單體的含量來代表單體的總量。這是因 為它們四種單體的含量占到了葡萄籽提取物中單體含 量的90．0％以上。原花青素的含量則為多酚含量與單 體含量相減之差。

此方法缺點是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、抗壞血酸等 易被氧化的物質(zhì)也參與Folin—Ciocalteau反應(yīng)。同時由 于葡萄籽提取物中沒食子酸含量甚微(0％～1．2％)，與 兒茶素(1．5％～7．3％)和表兒茶素(2．0％～5．1％)含量 相差懸殊四，原花青素含量用沒食子酸量來表示缺乏 代表性。

3．2．5 鉬酸銨分光光度法

它是基于鄰苯二酚與鉬酸銨在弱酸性介質(zhì)中生成 黃色鉬酸酯，反應(yīng)產(chǎn)物在333 nm波長處具有最大吸收。 馬亞軍 寸檢測條件進行了簡單摸索：取0．08 mol，L鉬 酸銨1 mL溶液置于25mL比色管，加人適量試液，用 1．OxlO mol／L鹽酸沖至刻度，反應(yīng)瞬間完成。

根據(jù)反應(yīng)原理，花色素、沒食子酸、兒茶素類都具 有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，也參與鉬酸酯的生成，測定原花青素 的選擇性不高，受到雜質(zhì)影響較大。

3．2．6 其它測定方法

馬亞軍 對原花青素含量測定方法進行了研究： 高鐵鹽一鐵氰化鉀分光光度法，它是基于原花青素能將 Fe 還原成Fe ，F(xiàn)e 與鐵氰化鉀生成可溶性深藍色配 位化合物，在710 nm處有最大吸收的原理；硫酸高鈰 銨分光光度法，它是基于原花青素與Ce“在強酸性介 質(zhì)中反應(yīng)生成無色的Ce ，Ce“在319 nm波長處具有 最大吸收，通過測定黃色高鈰鹽的吸光度，間接測定原 花青素。另外還有流動注射一抑制化學(xué)發(fā)光法[271：在堿 性條件下，利用原花青素還原H：O：可抑制魯米諾一 H20 體系的化學(xué)發(fā)光，其抑制的程度與原花青素濃度 之間呈線性關(guān)系。這三種方法如同F(xiàn)olin—Ciocaheau法 利用多酚的還原性質(zhì)測定多酚含量的原理，結(jié)果都擴 大了原花青素的含量。

綜上所述，原花青素值的測定只是根據(jù)經(jīng)驗公式， 并不是原花青素真實含量，與現(xiàn)代檢測方法相落伍。鐵 鹽催化法測定原花青素專屬性較強，有很好的應(yīng)用前 景，但仍需要進一步的研究與改進。香草醛法測定的是 原花青素和黃烷一3一醇單體的總量，與HPLC法檢測黃 烷一3一醇單體：兒茶素、表兒茶素含量相結(jié)合起來可以 計算原花青素的含量。但是香草醛法操作方式較多，不 利于使用者選擇，具體操作方法還需要進行統(tǒng)一。國外 有學(xué)者利用HPLC／MS技術(shù)分析和檢測原花青素，過程 比較復(fù)雜，技術(shù)要求高，不能廣泛應(yīng)用于原花青素產(chǎn)品 的測定。

4 展望

葡萄籽原花青素擁有高效的抗衰老、抗心血管疾 病、抗癌功能，此外還具有抗輻射、抗疲勞，改善記憶力 等作用，顯示出了無比的優(yōu)越生物活性和安全性。目前 我國生產(chǎn)和銷售葡萄籽提取物就有50多家，年生產(chǎn)能 力超過80 t。因此，為了與葡萄籽提取物行業(yè)的蓬勃發(fā) 展相適應(yīng)，迫切需要建立起統(tǒng)一的葡萄籽及其產(chǎn)品中 原花青素含量的測定方法，以利于企業(yè)的生產(chǎn)貿(mào)易、產(chǎn) 品的質(zhì)量控制和顧客的消費指導(dǎo)
花青素能夠增強血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)和增進皮膚的光滑度，抑制炎癥和過敏，改善關(guān)節(jié)的柔韌性。具體來說，花青素有如下幾種作用：
1. 有助于預(yù)防多種與自由基有關(guān)的疾病，包括癌癥、心臟病、過早衰老和關(guān)節(jié)炎；
2. 通過防止應(yīng)激反應(yīng)和吸煙引起的血小板凝集來減少心臟病和中風(fēng)的發(fā)生；
3. 增強免疫系統(tǒng)能力來抵御致癌物質(zhì)；
4. 降低感冒的次數(shù)和縮短持續(xù)時間；
5. 具有抗突變的功能從而減少致癌因子的形成；
6. 具有抗炎功效，因而可以預(yù)防包括關(guān)節(jié)炎和腫脹在內(nèi)的炎癥；
7. 緩解花粉病和其它過敏癥；
8. 增強動脈、靜脈和毛細血管彈性；
9. 保護動脈血管內(nèi)壁；
10. 保持血細胞正常的柔韌性從而幫助血紅細胞通過細小的毛細血管，因此增強了全身的血液循環(huán)、為身體各個部分的器官和系統(tǒng)帶來直接的益處，并增強細胞活力；
11. 松弛血管從而促進血流和防上高血壓（降血壓功效）；
12. 防止腎臟釋放出的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶所造成的血壓升高（另一個降血壓功效）；
13. 作為保護腦細胞的一道屏障，防止淀粉樣β蛋白的形成、谷氨酸鹽的毒性和自由基的攻擊，從而預(yù)防阿爾茨海默氏??；
14. 通過對彈性蛋白酶和膠原蛋白酶的抑制使皮膚變得光滑而富有彈性，從內(nèi)部和外部同時防止由于過度日曬所導(dǎo)致的皮膚損傷等等。