檸檬酸的作用是什么？

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，又名枸櫞酸，無色晶體，常含一分子結(jié)晶水，無臭，有很強(qiáng)的酸味，易溶于水。其鈣鹽在冷水中比熱水中易溶解，此性質(zhì)常用來鑒定和分離檸檬酸。結(jié)晶時(shí)控制適宜的溫度可獲得無水檸檬酸。在工業(yè)，食品業(yè)，化妝業(yè)等具有極多的用途。

主要用途：

1、用于食品工業(yè)，因?yàn)闄幟仕嵊袦睾退斓乃嵛叮毡橛糜诟鞣N飲料、汽水、葡萄酒、糖果、點(diǎn)心、餅干、罐頭果汁、乳制品等食品的制造。

2、用于化工和紡織業(yè)，檸檬酸在化學(xué)技術(shù)上可作化學(xué)分析用試劑，用作實(shí)驗(yàn)試劑、色譜分析試劑及生化試劑；用作絡(luò)合劑，掩蔽劑；用以配制緩沖溶液。

3、用于環(huán)保，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液用于煙氣脫硫。

4、用于禽畜生產(chǎn)，在仔豬飼料中添加檸檬酸，可以提早斷奶，提高飼料利用率5%～10%，增加母豬產(chǎn)仔量。

5、用于化妝品，檸檬酸屬于果酸的一種，主要作用是加快角質(zhì)更新，常用于乳液、乳霜、洗發(fā)精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。

6、用于殺菌，檸檬酸與80℃溫度聯(lián)合作用具有良好殺滅細(xì)菌芽孢的作用，并可有效殺滅血液透析機(jī)管路中污染的細(xì)菌芽孢。

7、用于醫(yī)藥，在凝血酶原激活物的形成及以后的凝血過程中，必須有鈣離于參加。枸櫞酸根離子與鈣離子能形成一種難于解離的可溶性絡(luò)合物，因而降低了血中鈣離子濃度，使血液凝固受阻。該品在輸血或化驗(yàn)室血樣抗凝時(shí)，用作體外抗凝藥。

如何利用透析法進(jìn)行脫鹽濃縮蛋白？

二、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。

其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。

2、等電點(diǎn)沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。

3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。

超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex

ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT

FACE=宋體

LANG=ZH-CN>纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。（詳見層析技術(shù)章）

（四）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法

親和層析法（aflinity

chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）

和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

細(xì)胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。

4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。

濃縮、干燥及保存

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮

通過降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。

2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮

空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。

3、冰凍法

生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中，操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。

4、吸收法

通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。

5、超濾法

超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^膜時(shí)，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發(fā)展起來的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對(duì)超濾效果的一定影響。Diaflo

超濾膜的分子量截留值：

膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑

XM－300300，000140

XM－200100，00055

XM－5050，00030

PM－30 30，00022

UM－2020，00018

PM－1010，00015

UM－21，00012

UM05500 10

用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動(dòng)。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當(dāng)緩沖液流過纖維管時(shí)，則小分子很易透過膜而擴(kuò)散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由于透析面積增大，因而使透析時(shí)間縮短10倍。